水泉小学唯一的老师高老师因为家中有事，不得不暂时请假回家。村长不得不从隔壁的村子找来了一个十三四岁的女孩魏敏芝来代替高老师上课。高老师觉得她年纪小，可是无奈找人不容易，只好嘱咐魏敏芝每天给他们抄课文，准确点清人数，一个都不能少。原本30多个学生，因为家里负担不起，所以只剩下了26个。
学生都觉得这个老师太年轻了，没有老师的样子便开始欺负她，整个教室都乱哄哄的。张慧科是班上的学习委员，可是家里穷，母亲又病卧在床，所以他不得不到城里打工挣钱。魏敏芝得知情况后，呼吁同学一起凑钱去找他回来。
魏敏芝到达城里后，历经辛苦，在好心人的帮助下才找到了张慧科，而且这些山区的孩子得到了社会的很大关注…
《一个都不能少》整套电影以纯真、朴实、自然的拍摄手法，带出现今中国山区的基础教育推行的实况和问题，流露出真挚的情感、动容的气氛。片末只以学生用七彩粉笔写字的情景作结，并没有交代水泉小学的发展及高老师的复职，给现众留下了想象的空间，这亦正是我们该对山区教育推行问题加以正视的地方。